产品目录

总外泌体(Exosomes)提取试剂盒(尿液用，超纯)适用于从动物尿液样本中提取总外泌体。不需要超速离心，仅需通过简单的常规离心即可从样本中获取大量结构完整的外泌体，具有快速简单，提取效率高的特点，可节省更多的实验时间和样本。提取的外泌体可根据实验目的用于后续的多种实验，应用范围广泛。
本试剂盒不适合唾液和乳汁的外泌体提取，需要用于唾液、乳汁外泌体提取请选用我公司其它产品编号的试剂盒(相关产品：HR8208)。
传统的尿液中分离和提取exosome的主要方法是超速离心法，这种方法缺点是耗时耗力，往往需要30～70个小时，每次最多只能处理6个样品，需要大量的起始材料，而且产量不高。
我公司的外泌体快速提取试剂盒系列产品，可以通过简单离心快速高效获得高纯度外泌体颗粒。本试剂盒提取的外泌体完好无缺，能用于各种功能研究、蛋白分析及RNA分析、电镜分析、NTA粒径分析等下游实验应用。
本试剂盒按每个样本处理4mL尿液计，每个50T试剂盒大约可以用于提取200mL尿液。
如果需要处理大量的尿液样本，将提取液按与尿液的体积比1：4加入尿液样本中即可。


● 使用方便，无需超速离心，省时省力；
● 纯度高，富集量大，应用范围广；
● 获取的Exosome结构和功能完整；
● 稳定性好，便于运输，便于保存。

组份	20T	50T
组份A：外泌体提取液A	20mL	50mL
组份B：外泌体保存液B	15mL	30mL
组分C：外泌体纯化离心管C	4套	10套

提取液、保存液2～8℃保存，离心管室温保存。有效期1年。
注：
● 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。


移液器，离心机，PBS，HBSS，纯水


● 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂。
● 以下以4mL尿液为例，实际操作按尿液和提取液A用量体积比4：1使用即可。
● 不同尿液中所含的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择尿液样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的尿液样本。
● 除非已经确认尿液样本中含有较多外泌体或者尿液样本较难获得，一般尿液样本建议每个样尿液用量不少于8mL。最好能上样量为15～20mL及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的尿液样本。
● 条件允许的情况下可以将尿液样本浓缩后再提取外泌体。
● 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。


外泌体提取：
1.收集4mL待提取的尿液样品，置2～8℃保存。
注：
● 冻存样品置水浴锅解冻后置2～8℃保存。
2.将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
3.小心将上清移入另一干净离心管中。
4.将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
5.小心将上清移入另一干净离心管中。
6.在4mL上清中加入1mL提取液A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。
注：
● 试剂A使用前请充分混匀。
7.置2～8℃冰箱静置过夜。
注：
● 静置保存时间不少于10小时。
8.在4℃条件下，10000×g离心60分钟。
9.小心移除上清，收集沉淀。
注：
● 尽可能吸干上清。
● 吸取时小心，防止吸掉沉淀。
10.取500μL外泌体保存液将沉淀重悬，用移液器轻轻吹打混匀，得到外泌体沉淀重悬液，进行下列外泌体纯化步骤操作。
清洗外泌体纯化离心管：
1.用缓冲液或纯水进行预清洗。
2.离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
注：
● 可以在外泌体提取步骤中需要使用前再清洗。
● 重复使用时要仔细检查管壁上有没有裂纹。
外泌体纯化：
1.将外泌体纯化离心管内管插入所提供的一个微量离心管中。
2.向内管中加入过500μL的外泌体沉淀重悬液样本，并盖上盖子。
注：
● 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
● 加外泌体悬液或Buffer到内管时，可以用蓝吸头；但从内管管底吸取纯化好的外泌体时，必须用黄吸头。
3.将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的离心管平衡。

4.以5000～8000×g离心约10～15分钟。离心至大约剩余50μL～100μL液体。
注：
● 离心至大约剩余50μL～100μL液体即可，不要过度浓缩。
● 如果外泌体样本的起始浓度很高，请监控离心过程，以免样本过度浓缩。过度浓缩会导致沉淀，这也可能带来样本损失。第一次做新样品时，可以离心几分钟后观察剩余液体大概体积。
● 建议将滤过液吸入1.5mL带盖的离心管(自备)中保存，一直保留到外泌体的样品分析测试完成。避免吸头戳破滤膜导致外泌体损失。
● 影响流速的因素包括样本浓度、相对离心力、离心转子的角度以及温度。500μL样本的典型离心时间大约是10～20分钟。大部分样本在离心开始后的前5～10分钟发生过滤纯化，但在离心10～30分钟后才能达到最低的纯化液体积(20μL)。
● 可以将浓缩的外泌体用PBS或HEPES等缓冲液(根据下游实验需要选择)稀释，再次离心至大约剩余50μL～100μL，这样的外泌体纯度将再次提高，残余的外源蛋白质和核酸更少。
5.离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
注：
● 外泌体可能会有少量的吸附损失，吸附损失取决于外泌体浓度、与过滤纯化内管表面接触的温度和时间。为了最大限度降低损失，离心后请立即回收过滤后的外泌体样本。
6.为了回收纯化后的外泌体，将内管倒过来插在另一个干净的微量离心管中。放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；用一个类似的离心管进行平衡。

7.以1000×g离心2分钟，使纯化后的外泌体样本从纯化内管转移到收集管中。
注：
● 要达到理想的回收效果，请尽早进行倒置离心。
● 也可不倒置离心，直接用移液器直接吸出内管中的样品。
● 从内管管底吸取纯化好的外泌体时，必须用黄吸头。
● 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
8.吸取收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。
注：
● 可以根据下游实验需要，用相应的缓冲液稀释保存外泌体。
● 也可直接用于蛋白提取。
● 将外泌体样本-80℃保存或直接用于下游应用。
● 外泌体短期保存可以置于2～8℃保存即可，一周以上长期不用时置-80℃保存。
● 保存前可以用0.22μm或0.35μm滤器过滤除菌。
9.用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。
注：
● 洗涤内管时，加入400μL PBS缓冲液或其它缓冲液，用吸头反复吹打，吸掉缓冲液即可。
● 用PBS洗涤3～4次。
● 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
● 每个离心管内管建议重复使用5次，不要超过10次。
● 加外泌体悬液或Buffer到内管时，可以用蓝吸头；但从内管管底吸取纯化好的外泌体时，必须用黄吸头。
● 如果使用过的离心管需要长期保存，可以按下列方法清洗和保存离心管内管。
外泌体纯化离心管清洗和保存：
1.使用后用水冲洗干净；
2.内管加入超纯水500μL,5000g离心5分钟；
3.吸净内管中的水，加入500μL 0.1M NaOH,5000g离心20分钟；
4.用0.1M NaOH浸泡24小时；
5.用水冲洗干净；
6.用无菌水浸泡2～8℃保存。
7.外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。
注：
● 1个月不用的话，直接用100mM的NaOH保存！更长时间的话加0.02%的叠氮钠。
● 再次使用前，用纯水充分冲洗干净，然后根据下游实验需要，用相应的缓冲液平衡。


● 准备做外泌体siRNA的NGS测序，初始样品量需要准备多少？
普通尿液样本建议使用40mL以上的初始样品量。由于某些尿液中外泌体含量比较低，建议先将样品浓缩，准备40mL以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。
● 如何鉴定提取的外泌体？
通常使用透射电镜检测(形态)、粒径检测(大小)、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。
● 外泌体WB标志蛋白用什么？
在进行WB检测时，通常检测外泌体标志蛋白为CD63、CD9、CD81、TSG101、ALIX、HSP70等。
● 进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？
没有，该检测属于定性检测。
● 蛋白浓度低？
很多外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大尿液的上样量。
处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。
● 抽提得到的RNA浓度低？
很多外泌体量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大尿液的上样量。
● 外泌体纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约10～20μL。
● 可以重复使用过滤管么？
可重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。
● 外泌体在纯化时出现了沉淀，如何改进？
如果过滤过快或者过度浓缩都有可能引起沉淀。如果样品的外泌体浓度很高，建议降低最终的外泌体浓度，保留更多的液体。
对于因过滤速度敏感而导致的沉淀，建议的改进方法是：
1)离心力降低30%～50%；
2)在过滤过程中取出过滤管，用枪头反复吹吸几次。
● 有时候用外泌体纯化离心管连水都离不下来，可能是什么原因？
如果出现这种情况，可能时过滤膜的孔被堵住。请先用0.1M NaOH清洗再离心。
最后用缓冲液或纯水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。
● 说明书中推荐在室温下进行离心，考虑到外泌体的稳定性，是否可以在4℃进行离心？
可以，但是低温可能会增加外泌体样品的粘性，导致流速减慢，建议可将离心时间延长。
相关搜索：高纯度外泌体提取试剂盒(尿液)，High purity Exosomes Extraction Kit for urine